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    動物醫學實驗


    一、裸鼠成瘤模型

    (1) 實驗原理

    腫瘤是危害人類生命健康最嚴重的疾病之一,在不少國家,腫瘤的死亡率僅次于心血管疾病而占第二位。在我國,腫瘤也是一大類常見病,多發病。怎樣預防和控制腫瘤是世界性的醫學難題。裸鼠是隨著近代醫學的發展,特別是腫瘤學和免疫學研究的需要,在近十幾年中發展起來的動物模型,由于裸鼠的免疫缺陷,在一定情況下,不排斥來自異種動物的組織移植,因此,可用其建立理想的人類腫瘤可移植實驗動物腫瘤模型。人體腫瘤移植于免疫缺陷動物(裸鼠),能保持其生物學特性,用于研究人體腫瘤對藥物的敏感性有很大幫助。早期工作是將人體腫瘤移植于動物缺乏免疫機能的特殊部位,如雞胚、動物的眼前房、倉鼠頰囊內等,雖有一定比例的成活率,但因腫瘤生長緩慢又受移入部位包膜的限制,腫塊往往較小,難于傳代,更不能適應需要較多瘤源的實驗治療工作。因此,利用裸鼠建立腫瘤模型進行防治研究,是基礎醫學研究中的重要課題。


    (2) 應用簡介

    裸鼠皮下荷瘤是指將人源或鼠源細胞注射到免疫缺陷的Balb/c 裸鼠皮下,通過施加藥物或其它條件來驗證細胞成瘤或轉移能力的實驗方法。裸鼠腫瘤模型是研究腫瘤學、免疫學、藥品與生物制品的安全性評價以及有效性篩選等研究課題的基礎。


    (3) 實驗方法

    Step1:準備細胞樣品,生理鹽水重懸:對接種環境進行消毒,用注射器進行細胞重懸,酒精棉球對裸鼠注射部位消毒后,取對數生長期的細胞,制成濃度為1*107/ml的細胞懸液。

    Step2:細胞計數,注射細胞到裸鼠皮下:按照分組進行接種,每只裸鼠于右腋皮下緩慢接種150μl細胞懸液,拔針后迅速用針頭將細胞聚集,防止細胞液外漏。

    Step3:觀察記錄成瘤情況

    Step4:處死裸鼠,取出腫瘤,做進一步研究


    (4) 案例展示

     


    (5) 常見問題

    ①細胞狀態對成瘤影響很大,在計劃做荷瘤實驗時務必確保細胞處于一個較好的狀態,一般注射細胞數目不少于1*106個。

    ②雖然裸鼠具有一定的免疫缺陷,但并不等于完全沒有排異反應,一般選擇年齡不超過7周齡的裸鼠進行實驗,年齡太大可能會影響成瘤效果。

    ③注射位點的選擇也有一定技巧性,一般選擇裸鼠腋下位置注射是因為這個位置血流豐富,易于短時間成瘤。

    ④建議在進行正式實驗之前,先開展預實驗,確定細胞的成瘤性。


    二、慢性抑郁型/EAE動物模型

    (1) 實驗原理

    抑郁是一種以情緒低落,思維遲純行為遲緩為主要癥狀的精神疾病,同時可伴有睡瞬減少,體重降體癥狀。

    模型制作:

    慢性溫和的不可預知性應激(chronicmildstress,CMS)甶Katz等于1981年創立,但缺點較多,如過強的應激刺激常導致動物死亡。由Willner等對其進行改進,是目前應用和研究較多的一種抑郁癥模型。讓大鼠在2?4周內每天經歷一種不愉快的輕度應激,包括冷水游泳(4°C , 5min),電擊(電流強度1.0mA,頻率1次/分),熱環境(45°C,5min),日夜顛倒,閃光刺激(3次/分),禁食,禁水,夾尾(1min)等刺激。每種刺激形式不連續2天出現,形成一種CMS,避免動物對同一種刺激產生適應。


    (2) 應用簡介

    抑郁模型可用于抗抑郁藥物的篩選及抑郁病理生理機制的研究,因其采用的刺激因子類似人在生活中經歷的應激事件強度,較好地模擬了人類快感缺乏、興趣降低這一核心癥狀,并且模型穩定持久,作為抑郁應激模型是理想的。


    (3) 實驗方法

    適應性喂養

    實驗小鼠保持自由飲水、進食,溫度23~25℃,動物房12g-12h晝夜交替,適應性喂養一周后進入實驗。

    EAE造模

    實驗鼠稱重,腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉(0.5ml/100g),背部備皮,酒精棉球消毒后各小鼠分別于背部中線兩側皮下4點注射抗原乳劑(MOG35-55)0.2ml。免疫當天(第0d)及48h(第2d)分別給模型各組小鼠腹腔注射PTX每只500ng(0.2ml)。誘導小鼠產生EAE。


    (4) 案例展示

     


    (5) 常見問題

    目前尚無公認的經典測量抑郁情緒的測驗,在各種抑郁模型動物中主要通過以下試驗測抑郁水平:多用敞箱試驗進行行為測評,表現為大鼠自發性探究行為明顯減弱,運動能力降低。體重減輕、性行為減少、血漿中糖皮質激素升高,睡眠周期縈亂。同時發現老鼠天生偏好糖水的興趣下降,運用糖水消耗試驗測定24h飲用1%蔗糖溶液的量,若糖水消耗顯菩降低,表示抑郁模型造模成功。


    三、大鼠心肌梗死/脊髓損傷模型

    (1) 實驗原理

    SD大鼠心肌梗死模型

    通過結扎左冠狀動脈前降支(LAD)制作心肌梗死模型。

    大鼠脊髓損傷實驗動物模型

    脊髓損傷模型種類繁多,各有其優缺點,在應用時應根據具體實驗研究目的和條件作出科學的選擇。目前,國內脊髓損傷實驗研究最常選用的動物是大白鼠、兔、貓、犬。體型較大的動物在實際的實驗操作中存在如下不利因素:手術操作步驟相對復雜,切口容易感染,容易死于術后的脊髓損傷并發癥,一定程度影響了實驗結果。大鼠作為一種價格便宜、容易飼養的動物,作為制作脊髓損傷模型還有如下特點:再現性好;臨床相關性好;與人類高度同源性;重復性強;適應范圍廣;操作簡單;死亡率低等。


    (2) 應用簡介

    SD大鼠心肌梗死模型

    實驗建立的標準化心肌模型可進一步用于心室重構機制和治療方面的研究,甚至對各相關領域研究的相互參考和借鑒都能起到重大作用。

    大鼠脊髓損傷實驗動物模型

    脊髓損傷的治療作為臨床上的一大難題,建立良好的動物模型對于該項疾病的研究至關重要。脊髓損傷的修復與再生成為研究重點,只有建立標準的、可重復性高的動物模型才能進行治療方面的進一步研究。


    (3) 實驗方法

    SD大鼠心肌梗死模型制備流程

    實驗鼠稱重,7%水合氯醛按5ml/kg 行腹腔注射麻醉。頸部、胸部備皮,用酒精棉球對手術區消毒,頸部正中切口,鈍性分離兩側肌肉暴露氣管,于大鼠口腔行氣管插管后接小動物呼吸機,保持呼吸穩定后在左胸前第3、4肋間作橫切口,依次鈍性分離各層肌肉,小心剪開肋間肌,暴露心臟后撕破心包膜,擠出心臟在左心耳的右緣下1-2mm處、肺動脈圓錐左緣處用圓針穿過左冠狀動脈前降支下方的心肌表層,用5-0線結扎,結扎成功后,可觀察到結扎血管以下心室壁稍變白,立即將心臟放入胸腔并縫合胸腔,用注射器將胸腔內空氣抽出,確定無開放性氣胸后依次縫合胸壁各層組織。大鼠術后恢復自主呼吸后拔除氣管插管。

    大鼠脊髓損傷實驗動物模型制備流程    

    實驗鼠自購回后動物房12h-12h晝夜交替,保持大鼠自由飲水、進食,溫度23-25℃,適應性喂養一周后進入實驗。

    Wistar大鼠稱重,采用7%水合氯醛5ml/kg腹腔注射麻醉后,俯臥位固定于手術臺上,以T10棘突為中心,備皮,酒精消毒后取背部正中切口,長約2cm,依次切開皮膚、皮下組織,切開并分離脊柱兩側肌肉及筋膜,顯露T9~T11椎體棘突及椎板。然后用止血鉗小心咬除T10及附近棘突與椎板,暴露并保持硬脊膜的完整。用2.2×5mm弧形面與脊髓接觸,壓迫為質量50g的重物,壓迫時間5min,大鼠雙后肢癱瘓證明造模成功。逐層縫合肌肉及皮膚。


    (4) 案例展示

    SD大鼠心肌梗死模型

    大鼠脊髓損傷實驗動物模型 


    (5) 常見問題

    ①器械:動物呼吸機。開胸制作心梗模型,維持呼吸至關重要。雖然據說某些牛人可以不用呼吸機,但是我想這是經驗積累的結果,開始時必然要用;況且需要看此說明的人應該沒有牛到這個程度。當然,如果你經費異常充足,不在乎死亡成千上萬的大鼠也可以。顯微器械,最主要的是針持,大鼠胸腔、心臟均很小,常規器械無法進入胸腔縫扎。其他手術器械以眼科器械為主。

    ②動物:應選擇成年健康大鼠,耐受性較好。最重要的是要充分利用每一只動物,包括死亡的大鼠。許多人都知道制作大鼠模型需要多練習,但是練習不是買一大批大鼠,不停地縫扎,然后不停地扔掉死的大鼠;當然,制作心梗模型死亡一些大鼠是很正常的事情。練習的前提是對大鼠解剖及操作過程的熟悉,如果可能的話,最好先找一份大鼠的解剖圖譜,熟悉手術區域的解剖結構;同時研究實驗流程,熟悉每一個實驗步驟。大鼠死亡后,不要急著扔掉,利用它練習每一個你不熟悉的操作步驟,直到熟練為止。

    ③實驗者:實驗者必須具有一種平和的、耐得住寂寞的心態,制作模型需要時間,尤其是早期,需要耐心、仔細的摸索;必須對每一個步驟進行認真地研究。最熟練的制作者做一只大鼠模型也需要30到40分鐘的時間,加上準備及掃尾的時間,制作十只模型就需要一天的時間,如果你廢寢忘食多用用功也可能做到15只左右,這樣一天下來腰酸背痛是必然的,你能堅持多久?不熟練的話,一只就要兩、三個小時;同時還要看著大鼠在你的手中死亡,這是很揪心的事情。因此,實驗者必須具備良好的心態,急于求成、難耐寂寞者不適合做此實驗。

    本文系氣管切開插管,縫扎LAD制作模型。亦有經口插管,液氮冷凍制作模型。



    四、急性胰腺炎/結腸炎大鼠模型

    (1) 實驗原理

    急性胰腺炎

    急性胰腺炎(Acute Pancreatitis,AP)是非常普遍的臨床病癥,屬于免疫紊亂引起的疾病,多數患者發病于膽管疾病或者過量酒精攝入。臨床病理表現隨疾病的嚴重程度而不同,從輕微、自限性的疾病形式,發展至并發膿毒癥、多器官衰減的急性重癥胰腺炎(Severe acute pancreatitis,SAP),引起高達30-40%的死亡率。由于目前對其發病機制仍未完全闡明,臨床上缺乏特效的手段阻止胰腺組織壞死的發生和發展。

    潰瘍性結腸炎

    潰瘍性結腸炎(UC)是一種主要累及直腸、結腸黏膜的慢性非特異性炎癥,以腹痛、腹瀉、粘液血便等為主要臨床表現。


    (2) 應用簡介

    急性胰腺炎

    在臨床研究中建立與人類發病機制最為接近的動物模型,從而認識和探討發病機理,也為驗證治療手段和治療藥物的可行性提供最重要的數據支持。

    潰瘍性結腸炎

    建立一種類似于人類UC的動物模型,對研究UC的發病機制、病變發展規律和臨床治療有著重要的應用價值。


    (3) 實驗方法

    急性胰腺炎建模

    實驗大鼠自購回后保持其自由飲水、進食,溫度23-25℃,動物房12h-12h晝夜交替,適應性喂養一周后進入實驗。

    實驗大鼠稱重,7%水合氯醛(5ml/kg)腹腔注射進行麻醉,仰臥位固定大鼠,正中切口進入腹腔;找到胃十二指腸交界處,再向下找到膽胰管十二指腸開口處;1ml注射器穿刺進入十二指腸粘膜內的膽胰管開口并深入1cm;用兩枚動脈夾臨時夾住膽胰管肝門部和穿刺針,以防注射脫氧膽酸鈉時液體流入肝臟和十二指腸;向膽胰管內勻速注射1.5%脫氧膽酸鈉(用藥劑量1.0ml/kg,注射速度0.2ml/min);注射完畢后繼續阻斷膽胰管上下端5min,移去夾在膽胰管上下端的動脈夾;補充腹水,兩層關腹。

    潰瘍性結腸炎大鼠模型構建

    大鼠自購回后保持其自由飲水、進食,溫度23-25℃,動物房12h-12h晝夜交替,適應性喂養一周后進入實驗。

    模型鼠以200g/L蜂蜜水自由飲用,隔日按大鼠體重灌服豬油(灌胃劑量15g/kg,灌胃前先加熱融化),并與油脂隔日灌服白酒(灌胃劑量20ml/kg),共灌服20d。第6天和第20天于大鼠的左、右側足跖、腹股溝及背部五點注射抗原乳化液1ml(含抗原8mg).各組大鼠于第21天禁食36h,用7%水合氯醛(5mL/kg)麻醉,用硅膠管由肛門輕緩插入8-10cm,正常對照組用生理鹽水2.5ml灌腸,模型組用灌腸液按照2.5ml/只的劑量灌腸(灌腸完畢后提起大鼠尾部,倒置1min)。


    (4) 案例展示

     

    急性胰腺炎

     

    潰瘍性結腸炎大鼠


    (5) 常見問題

    ①動物未出現預期效果或死亡率較高:需要控制好藥物劑量

    ②一般實驗室構建的為急性胰腺炎模型,不適宜做長期給藥實驗;



    五、大鼠顱腦損傷/MCAO模型

    (1) 實驗原理

    大鼠MCAO模型

    MCAO即大腦中動脈閉塞,該模型阻斷頸外動脈及其分支,且阻斷翼腭動脈,以切斷顱外來源的側副循環血流。從頸外動脈插入栓線,經頸內動脈到大腦前動脈,機械性阻斷大腦中動脈發出處的血供來建立大腦中動脈缺血模型。

    大鼠顱腦損傷

    創傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)是全球范圍內主要的致死致殘因素之一,通過一系列神經化學分子和信號的改變引起神經功能的紊亂,從而導致患者在行為、認知和記憶方面的損害。


    (2) 應用簡介

    大鼠MCAO模型

    腦卒中又稱“中風”、“腦血管意外”,是一種急性腦血管疾病,包括缺血性和出血性卒中,其中缺血性腦血管病占60-70%。

    卒中又名大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO),是一種局灶性腦缺血模型,目前應用最廣泛的腦缺血模型。其發病機理與人類缺血性腦卒中表現相似,對于制作模擬人腦缺血模型對腦缺血發病機制及藥物篩選有重要意義。

    大鼠顱腦損傷

    盡管對于 TBI 的研究投入了大量的人力財力,但由于其復雜的病理生理學機制,至今沒有有效的治療方案,如何提高這部分病人的生存率對我們的臨床工作有重要意義。


    (3) 實驗方法

    動物適應性喂養

    動物自購回后保持動物房12h-12h晝夜交替,保持動物自由飲水、進食,溫度23-25℃,適應性喂養一周后進入實驗。

    大鼠MCAO模型構建

    參照改良Zea Longa線栓法構建大鼠MCAO模型。大鼠術前12h禁食不禁水。

    大鼠稱重,7%水合氯醛(0.5ml/100g)腹腔注射麻醉,頸前部備皮、消毒,行頸正中切口,鈍性分離右側皮下組織及肌肉暴露出頸總動脈,眼科鑷小心分離伴行于頸總動脈的迷走神經及動脈周圍粘膜組織,分離出頸總動脈大約1~1.5cm.繼續向頭部分離,小心剔除覆蓋于動脈上方的粘膜組織,可見頸外動脈、頸內動脈與頸總動脈呈“Y字形”分布,游離出獨立的頸內、外動脈。結扎頸外動脈及頸總動脈近心端,頸內動脈埋線并用動脈夾暫時夾閉。在頸總動脈近心端結扎處剪一“V”形切口,用眼科鑷夾持栓線由頸總動脈進入頸內動脈,到達動脈夾時,將埋線稍微拉緊(防止滲血),松開動脈夾,繼續插入栓線,當特制栓線黑色標記處到達Y字形分叉口附近時,此時栓線已進入大腦中動脈且不能繼續前行。

    檢測

    栓線插入完畢后,將預留的結扎線拉緊固定。醫用棉簽清理頸部血塊,縫合皮膚,酒精棉球消毒,將大鼠放回籠子。90min過后,麻醉大鼠,頸部消毒,打開一個小口,用眼科鑷夾住栓線固定處將栓線拔出約1cm實現血流再灌注,剪去多余栓線,逐層縫合。

    SD大鼠顱腦損傷模型(Feeney 自由落體法)

    實驗鼠稱重,7%水合氯醛麻醉(5ml/kg),頭部備皮,俯臥固定于顱腦損傷儀上。手術區酒精棉球消毒,將大鼠頭頂部皮膚失狀切開,剝離筋膜。以人字縫前3mm、冠狀縫右側3mm為圓心用顱骨鉆鉆孔并擴大骨窗(直徑5mm),鉆孔過程需注意不能損壞硬腦膜,將致傷撞墊輕輕置于骨窗中央的硬腦膜上,用40g的砝碼自20cm高處沿滑桿自由落體落下打擊撞墊(沖擊力為800g·cm),造成大鼠右頂葉局限性腦挫裂傷。骨蠟封窗,縫合頭皮。


    (4) 案例展示

     

    大鼠MCAO模型

     

    SD大鼠顱腦損傷模型


    (5) 常見問題

    1)分離頸部肌肉時,兩側小塊肌肉叫鼓泡腺體(很多人誤認為是甲狀腺),避免損傷導致出血。

    2)見到頸動脈鞘了則要注意細致分離迷走神經,若損傷則可能影響其呼吸而死亡的。

    3)分離血管時,要盡量將血管剝離的干凈些,這樣在用眼科剪剪口時就不會誤剪外膜,且要剪一個斜行的切口。

    4)系牢拴線繞在CCA遠心端的細線時注意掌握力度,不可不扎,否則出血較多,但不可過緊,否則插線困難

    5)線栓是分幾次一點點插進去的,而不是夾住線栓的中間部分一下子插進去的,直到遇到輕微阻力停止插線。


    六、動脈粥樣硬化/肺炎模型

    (1) 實驗原理

    動脈粥樣硬化模型

    常用的復制方法有下面幾種(包括高血脂模型):

    ①高膽固醇、高脂肪飼料喂養法:是目前比較常用的方法,特點是死亡率低,可長期觀察,但費時久。一般在家兔、鴿、雞等,經數周喂養就可產生明顯的高脂血癥,經數月就能形成早期的動脈粥樣硬化病變。大白鼠、小白鼠及犬則較難形成,如果飼料中增加蛋黃、膽酸和豬油等,可用促進作用。為了促進病變的形成,在高脂飼料中還可加入甲基硫氧嘧啶、丙基硫氧嘧啶、甲亢平、維生素D、蔗糖等。

    ②免疫學方法:將大白鼠主動脈勻漿給兔注射,可引起血膽固醇、β-脂蛋白及甘油三脂升高。

    ③注射兒茶酚胺類藥物法:可引起主動脈病變,呈現血管壁中層彈性纖維拉長、劈裂或斷裂,病變中出現壞死及鈣化。

    ④注入同型半胱氨酸法:冠狀動脈管腔變窄、動脈壁內膜肌細胞增生、纖維組織增生、彈力纖維斷裂、管壁變厚、基質中出現成堆的顆粒狀和纖維狀異染物質。

    ⑤注射表面活化劑法:其中以甘油三脂升高最強,其次是磷脂、游離脂肪酸及游離膽固醇,對膽固醇脂沒有影響。

    ⑥膽固醇一脂肪乳劑靜脈注射法:總膽固醇升高至正常的6倍,其中主要是游離膽固醇,游離膽固醇和總膽固醇的比值為90%。以后血漿總膽固醇逐漸降低,6小時時出現一低峰,后略有回升。3~4天后游離膽固醇和總膽固醇的比值接近正常(40%左右),直到7~14天血漿膽固醇恢復正常。

    ⑦幼乳大白鼠法:一般認為這種高膽固醇血癥對甲狀腺素及其衍生物類藥物非常敏感,而對某些膽固醇生物合成抑制劑則不敏感。

    ⑧其它方法:還有許多因素可誘發高脂血癥及動脈粥樣硬化癥。例如使動物腦部缺血、電刺激中樞神經系統、高度應激狀態、鳥類應用大劑量雌激素和暴露于CO環境、氣囊異管損傷動脈壁內皮細胞等。

    小鼠肺炎模型構建

    細菌性肺炎(bacterialpneumonia)占成人各類病原體肺炎的80%。然而過去30~40年中,由于細菌耐藥率的不斷增高,大量廣譜或超廣譜抗菌素投入臨床并未使肺炎的死亡率持續下降。有報告住院死亡病人約15%與肺炎有關。社區獲得性肺炎(CAP)死亡率為5%~10%,而醫院獲得性肺炎(HAP)的病死率則高達20%~50%。


    (2) 應用簡介

    動脈粥樣硬化模型

    動脈粥樣硬化(AS)是我國和世界上嚴重危害人類生命健康的疾病之一,其發病率和死亡率均居各種疾病前列,是嚴重影響人類健康的心血管疾病.因此建立一種脂質代謝和斑塊與人類相似的實驗性動脈粥樣硬化整體動物模型具有重要意義。

    小鼠肺炎模型構建

    肺炎的臨床癥狀趨于不典型,所謂“重癥”肺炎時有發生,尤其在嬰幼兒、老年人和免疫抑制患者中病死率極高。提高肺炎的病原學診斷水平,建立肺炎的動物模型,確立肺炎的動物診斷標準和肺炎動物模型的觀測指標,是臨床處理重癥肺炎迫切而急需解決的課題。


    (3) 實驗方法

    動脈粥樣硬化模型

    常用的復制方法有下面幾種(包括高血脂模型):

    膽固醇、高脂肪飼料喂養法:具體復制方法:兔誘發模型:體重2kg左右,每天喂服膽固醇0.3g,4個月后肉眼可見主動脈粥樣硬化斑塊;若每天劑量增至0.5g,3個月后可出現斑塊;若增至每天1g,可縮為2個月。在飼料中加入15%蛋黃粉、0.5%膽固醇和5%豬油,經3周后,將飼料中膽固醇減去,再喂3周,可使主動脈斑塊發生率達100%,血清膽固醇可長高至2000mg%。大白鼠誘發模型:喂服1~4%膽固醇、10%豬油、0.2%甲基硫氧嘧啶、86~89%基礎飼料,7~10天;或喂服10%蛋白黃粉、5%豬油、0.5%膽鹽、85%基礎飼料,7天后均可形成高膽固醇血癥。小白鼠誘發模型:雄性小白鼠飼以1%膽固醇及10%豬油的高脂飼料,7天后血清膽固醇即升為343±15mg;若在飼料中再加入0.3%的膽酸,連飼7天,血清膽固醇可高達530±36mg%。雞、鴿誘發模型:4~8周的萊克享雞,在飼料中加入1~2%膽固醇或15%的蛋黃粉,再加5~10%的豬油,經過6~10周,血膽固醇升至1000~4000mg%,胸主動脈斑塊發生率達100%。鴿喂飼膽固醇3g/kg/天,加甲基硫氧嘧啶0.1g,可以產生較多動物斑塊。

    ②免疫學方法:將大白鼠主動脈勻漿給兔注射,可引起血膽固醇、β-脂蛋白及甘油三脂升高。給兔注射馬血清10ml/kg/次,共4次,每次間隔17天,動脈內膜損傷率為88%,冠狀動脈亦有粥樣硬化的病變;同時給予高膽固醇飼料,病變更加明顯。兔喂飼含1%膽固醇的飲料,靜脈注射牛血清白蛋白250mg/kg,可加速高膽固醇飼料引起的動脈內膜病變形成。

    ③注射兒茶酚胺類藥物法:給兔靜脈滴注Norepinephrine1mg/日,時間為30分鐘。一種方法是先點滴15分鐘,休息5分鐘后再滴15分鐘;另一方法是每次點滴5分鐘和休息5分鐘,反復6次。

    ④注入同型半胱氨酸法:給兔皮下注射同型半胱氨酸硫代內脂(dl-homocysteine thiolactone)20~25mg/kg/日(以5%葡萄糖溶液配成1mg/ml的濃度),連續20~25天,成年兔及幼兔均可出現動脈粥樣硬化的典型病變。

    ⑤注射表面活化劑法:給大白鼠腹腔注射Triton WR1339 300mg/kg,9小時后使血清膽固醇升高3-4;20小時后雄性大白鼠血清膽固醇仍為正常的3~4倍,而雌性大白鼠卻為6倍左右;用藥后24小時左右升脂作用達最高點,48小時左右恢復正常。

    ⑥膽固醇一脂肪乳劑靜脈注射法:將膽固醇及豬油各3g在電磁加熱攪拌下完全溶解后加入吐溫-803g,攪勻,再緩緩加入丙二醇5ml和沸水的混合液,充分攪拌乳化,使成100ml,經抽濾后顯微鏡下檢查,乳劑顆粒均勻,并小于7~8μm即可應用。給兔耳緣靜脈注射5ml/kg,可見血漿膽固醇及甘油三酯立即升高。

    ⑦幼乳大白鼠法:一般乳幼大白鼠的血清膽固醇高于或成年大白的2~3倍,這是由于乳汁中脂肪含量很高,而甲狀腺功能尚不健全的緣故。若用一般飼料取代乳汁喂養,則血清膽固醇很快就能降至正常成年大白鼠的水平。選用出生25天的乳幼大白鼠,雌雄兼用,體重30~50g,在不脫離母鼠乳汁喂養的條件下,進行實驗觀察藥物的降血膽固醇作用,與對照組比較效果。

    ⑧其它方法:還有許多因素可誘發高脂血癥及動脈粥樣硬化癥。例如使動物腦部缺血、電刺激中樞神經系統、高度應激狀態、鳥類應用大劑量雌激素和暴露于CO環境、氣囊異管損傷動脈壁內皮細胞等。

    小鼠肺炎模型構建

    動物適應性喂養

    動物房12h-12h晝夜交替,保持C57BL/6小鼠自由飲水、進食,溫度23-25℃,適應性喂養一周后進入實驗。

    C57BL/6小鼠肺炎模型建模

    C57BL/6小鼠7%水合氯醛(0.5ml/100g)腹腔注射麻醉,麻醉成功后仰臥位固定于操作臺,頸部備皮、酒精棉球消毒,行頸部正中切口(約1.5cm),分離頸部皮膚、肌肉組織,暴露氣管,采用1ml注射器穿刺進針入氣管,按1ml/g緩慢滴注LPS(5mg/ml)溶液,注射完成后逐層縫合,回籠。


    (4) 案例展示

     

    C57BL/6小鼠肺炎模型建模

    (5) 常見問題

    ① 動脈粥樣硬化模型盡可能選擇高脂飲食聯合動脈內膜機械性損傷的方式建立。高脂飲食先于球囊損傷術,手術應在高脂飼料喂養 7-10 天后進行,即先有高脂誘因而又有動脈內膜損傷致病因素。

    ② 頸總動脈分離時盡可能分離干凈,否則夾閉不好易導致出血,不便于插入球囊損傷管。

    ③ 球囊損傷管到達頸總動脈中段后,進行反復牽拉時,用力一定要輕,以防動物意外死亡。


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